Diagnóstico Molecular


Sodré Neto·Há 7hEditor em Www.jornaldaciencia.com.br (2020–presente)Diagnóstico Molecular

Reação em cadeia da polimerase (PCR)

Uma técnica utilizada para amplificar, ou fazer muitas cópias de, uma região de interesse específica do DNA.Google Sala de aulaFacebookTwitterE-mail

Pontos Principais:

  • reação em cadeia da polimerase, ou PCR, é uma técnica para fazer muitas cópias de uma região específica do DNA, in vitro (em um tubo de ensaio, ao invés de um organismo).
  • A PCR depende de uma DNA polimerase termoestável, a Taq polimerase, e requer primers de DNA projetados especificamente para a região de interesse do DNA .
  • Na PCR, a reação é repetida ciclicamente através de uma série de alterações de temperatura, o que possibilita a produção de muitas cópias da região de interesse.
  • A PCR tem muitas aplicações práticas e em pesquisa. Ela é rotineiramente usada em clonagens de DNA, diagnósticos médicos e análises forenses de DNA.

O que é PCR?

reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica rotineira de laboratório usada para fazer muitas cópias (milhões ou bilhões) de uma região específica do DNA. Essa região do DNA pode ser qualquer objeto de interesse do pesquisador. Por exemplo, pode haver um gene cuja função o pesquisador queira compreender ou um marcador genético usado pelos cientistas forenses para correlacionar o DNA da cena do crime com os suspeitos.Tipicamente, o objetivo da PCR é fabricar quantidade suficiente da região de interesse do DNA, de modo que essa possa ser analisada e utilizada de alguma outra maneira. Por exemplo, DNA amplificado por PCR pode ser enviado para sequenciamento, visualizado por eletroforese em gel, ou clonado em plasmídeo para futuros experimentos.A PCR é usada em muitas áreas da biologia e medicina, incluindo pesquisa em biologia molecular, diagnósticos médicos e mesmo alguns ramos da ecologia.

Taq polimerase

Assim como a replicação de DNA em um organismo, a PCR requer uma enzima DNA polimerase que faça novas fitas de DNA usando as existentes como moldes. A DNA polimerase tipicamente usada na PCR é chamada de Taq polimerase, em homenagem à bactéria resistente ao calor da qual ela foi isolada (Thermus aquaticus).T. aquaticus vive em fontes termais e de água quente. Sua DNA polimerase é bastante estável ao calor e é mais ativa à 70 °\text C70°C70, °, start text, C, end text (temperatura em que as DNA polimerases humanas ou de E. coli seriam disfuncionais). Essa estabilidade ao calor torna a Taq polimerase ideal para PCRs. Como veremos, a alta temperatura é usada repetidamente na PCR para desnaturar o DNA molde, isto é, separar suas fitas.

Primers de PCR

Como outras DNA polimerases, a Taq polimerase consegue fabricar DNA somente quando lhe é dado um primer, uma sequência curta de nucleotídeos que fornece um ponto de partida para a síntese de DNA. Em uma reação de PCR, o pesquisador determina a região do DNA que será copiada, ou amplificada, pelos primers que ela ou ele escolher.Os primers de PCR são pedaços curtos de DNA de fita simples, geralmente por volta de 202020 aminoácidos de comprimento. Dois primers são usados para cada reação de PCR, e eles são projetados de modo que englobem a região de interesse (região que deve ser copiada). Isto é, são dadas sequências que os farão se ligar a fitas opostas do DNA molde, bem nas extremidades da região a ser copiada. Os primers se ligam ao molde por pareamento de bases complementares.

DNA molde:

5' TATCAGATCCATGGAGT...GAGTACTAGTCCTATGAGT 3'
3' ATAGTCTAGGTACCTCA...CTCATGATCAGGATACTCA 5'

Primer 1: 5' CAGATCCATGG 3'
Primer 2:

DNA molde:5′ TATCAGATCCATGGAGT…GAGTACTAGTCCTATGAGT 3′ 3′ ATAGTCTAGGTACCTCA…CTCATGATCAGGATACTCA 5’Primer 1: 5′ CAGATCCATGG 3′ Primer 2:Quando os primers são ligados ao molde, eles podem ser estendidos pela polimerase, e a região que está entre eles será copiada.

[Diagrama mais detalhado mostrando a direcionalidade do DNA e do primer]

As etapas da PCR

Os principais ingredientes de uma reação PCR são a Taq polimerase, primers, DNA molde e nucleotídeos (blocos que compõem o DNA). Os ingredientes são reunidos em um tubo, juntamente com cofatores de que a enzima precisa, e passam por repetidos ciclos de aquecimento e resfriamento que permitem que o DNA seja sintetizado.As etapas básicas são:

  1. Desnaturação (96 °\text C96°C96, °, start text, C, end text): Aquece fortemente a reação para separar, ou desnaturar, as fitas de DNA. Isso proporciona um molde de fita simples para a próxima etapa.
  2. Anelamento (555555 – 656565°\text C°C°, start text, C, end text): Resfria a reação para que os primers possam se ligar às suas sequências complementares no DNA molde de fita simples.
  3. Extensão (72 °\text C72°C72, °, start text, C, end text): Eleva a temperatura da reação para que a Taq polimerase estenda os primers, sintetizando novas fitas de DNA.

Este ciclo se repete 252525 – 353535 vezes em uma reação típica de PCR, que geralmente ocorre em 222 – 444 horas, dependendo do comprimento da região de DNA a ser copiada. Se a reação for eficiente (funcionar bem), a região de interesse pode gerar de uma ou poucas cópias até bilhões.Isso porque não é apenas o DNA original que é utilizado como molde a cada vez. Ao invés, o novo DNA feito em uma rodada pode servir de molde na próxima rodada de síntese de DNA. Há muitas cópias dos primers e muitas moléculas de Taq polimerase flutuando pela reação, então o número de moléculas de DNA pode aproximadamente dobrar a cada rodada do ciclo. Esse padrão de crescimento exponencial é mostrado na imagem abaixo.

Uso da eletroforese em gel para visualizar os resultados da PCR

Os resultados de uma reação PCR são geralmente visualizados (tornam-se visíveis) através do uso da eletroforese em gelEletroforese em gel é uma técnica na qual fragmentos de DNA são puxados por uma corrente elétrica através de uma matriz de gel, e que separa os fragmentos de DNA de acordo com o tamanho. Um padrão, ou escada de DNA, é tipicamente incluído para que o tamanho dos fragmentos nas amostras da PCR possa ser determinado.Fragmentos de DNA de mesmo comprimento formam uma “banda” no gel, que pode ser vista a olho nu se o gel for pigmentado com um corante que se liga ao DNA. Por exemplo, uma reação de PCR produzindo um fragmento de 400400400 pares de bases (pb) apareceria desta maneira no gel:

Coluna esquerda: Escada de DNA com bandas de 100, 200, 300, 400, 500 pb.

Coluna direita: resultado da reação PCR, uma banda em 400pb.

Coluna esquerda: Escada de DNA com bandas de 100, 200, 300, 400, 500 pb.Coluna direita: resultado da reação PCR, uma banda em 400pb.Uma banda de DNA contém muitas e muitas cópias da região de interesse do DNA, não apenas uma ou algumas cópias. Como o DNA é microscópico, muitas cópias têm de estar presentes antes que possamos vê-las a olho nu. Isso é uma grande parte do porquê de a PCR ser uma ferramenta importante: ela produz cópias suficientes de uma sequência de DNA de modo que possamos ver ou manipular aquela região de DNA.

Aplicações da PCR

Através da PCR, uma sequência de DNA pode ser amplificada milhões ou bilhões de vezes, produzindo cópias suficientes de DNA para serem analisadas por outras técnicas. Por exemplo, o DNA pode ser visualizado por eletroforese em gel, enviado para sequenciamento, ou digerido por enzimas de restrição e clonado em um plasmídeo.A PCR é usada em muitos laboratórios de pesquisa e também tem aplicações práticas em ciências forenses, testes genéticos e diagnósticos. Por exemplo, a PCR é utilizada para amplificar genes associados a desordens genéticas a partir do DNA de pacientes (ou do DNA fetal, nos casos de teste pré-natal). A PCR também pode ser utilizada para testar se há DNA bacteriano ou viral no corpo de um paciente: se o patógeno estiver presente, pode ser possível amplificar regiões de seu DNA a partir de uma amostra de sangue ou tecido.

Amostra-problema: A PCR nas ciências forenses

Suponha que você esteja trabalhando em um laboratório de ciências forenses. Você acabou de receber uma amostra de DNA de um cabelo deixado em uma cena de crime, juntamente com amostras de DNA de três possíveis suspeitos. Seu trabalho é examinar um marcador genético em particular e verificar se algum dos três suspeitos coincide com o DNA do cabelo para esse marcador.O marcador vem em dois alelos, ou versões. Um deles contém uma única repetição (região marrom abaixo), enquanto o outro contém duas cópias da repetição. Em uma reação PCR com primers que atuam na região de repetição, o primeiro alelo produz um fragmento de DNA de 200200200 \text{bp}bpstart text, b, p, end text, enquanto o segundo produz um fragmento de DNA de 300300300 \text{bp}bpstart text, b, p, end text:

Marcador do alelo 1: primers que atuam na região de repetição amplificam um fragmento de DNA de 200 pb

Marcador do alelo 2: primers que atuam na região de repetição amplificam um fragmento de DNA de 300 pb

Marcador do alelo 1: primers que atuam na região de repetição amplificam um fragmento de DNA de 200 pbMarcador do alelo 2: primers que atuam na região de repetição amplificam um fragmento de DNA de 300 pbVocê faz uma PCR nas quatro amostras de DNA e visualiza os resultados por eletroforese em gel, como representado abaixo:

O gel tem cinco faixas:

Primeira faixa: Escada de DNA com bandas de 100, 200, 300, 400, e 500 pb. 

Segunda faixa: DNA da cena do crime, banda de 200 pb.

Terceira faixa: DNA do suspeito #1, banda de 300 pb.

Quarta faixa: DNA do suspeito #2, bandas de 200 e 300 pb.

Quinta faixa: DNA do suspeito #3, banda de 200 pb.

O gel tem cinco faixas:Primeira faixa: Escada de DNA com bandas de 100, 200, 300, 400, e 500 pb.Segunda faixa: DNA da cena do crime, banda de 200 pb.Terceira faixa: DNA do suspeito #1, banda de 300 pb.Quarta faixa: DNA do suspeito #2, bandas de 200 e 300 pb.Quinta faixa: DNA do suspeito #3, banda de 200 pb.O DNA de qual suspeito coincide com o DNA da cena do crime para esse marcador?Escolha 1 resposta:Escolha 1 resposta: 3

Humanos são diploides, o que significa que têm duas cópias da maioria de seu DNA. Assim, haverá duas cópias do marcador que estamos avaliando em cada uma das amostras de DNA.Se uma pessoa tem dois diferentes alelos do marcador (é heterozigótica), duas bandas de diferentes tamanhos (200200200 pb e 300300300 pb) serão amplificadas durante a PCR. Elas aparecerão como bandas de DNA dentro do gel nas localizações para 200200200 pb e 300300300 pb.Se uma pessoa tem duas cópias do mesmo alelo (é homozigótica), apenas uma banda será amplificada durante a PCR. Se a pessoa for homozigota para o alelo de 200200200 pb, apenas a banda de 200200200 pb será visível no gel. Similarmente, se a pessoa for homozigota para o alelo de 300300300 pb, apenas a banda de 300300300 pb será visível no gel.Os genótipos do marcador das amostras de DNA são:

  • DNA da cena do crime: alelo homozigoto de 200200200 pb
  • Suspeito 111: alelo homozigoto de 300300300 pb
  • Suspeito 222: heterozigoto
  • Suspeito 333: alelo homozigoto de 200200200 pb

Tanto a amostra de DNA da cena do crime quanto a amostra de DNA do suspeito 333 são homozigotas para a versão de 200200200 pb do marcador. Isso é, as duas amostras coincidem para esse marcador.CorretoVerificar

Mais sobre PCR e ciências forenses

Em testes forenses reais com o DNA da cena do crime, os técnicos fariam uma análise conceitual similar à representada no exemplo acima. Contudo, uma série de marcadores diferentes (não apenas o único marcador do exemplo) seria comparada entre o DNA da cena do crime e o DNA do suspeito.Ademais, os marcadores usados em análises forenses típicas não vêm apenas em duas formas diferentes. Em vez disso, eles são altamente polimórficos (poli = muitas, morfo = formas). Isto é, eles vêm em muitos alelos que variam minimamente em comprimento.O tipo mais comum de marcadores usado nas ciências forenses, chamado microssatélites (STRs na sigla em inglês), consiste em várias cópias da mesma sequência curta de nucleotídeos que se repetem (tipicamente, 222 a 555 nucleotídeos de comprimento). Um alelo de um STR pode ter 202020 repetições, enquanto outro pode ter 181818 e um outro apenas 101010^11start superscript, 1, end superscript.Por meio do exame de múltiplos marcadores, cada um dos quais vem em muitas formas de alelos, os cientistas forenses podem montar uma “impressão digital” singular a partir de uma amostra de DNA. Em uma análise típica de STR usando 131313 marcadores, as chances de um falso positivo (duas pessoas tendo a mesma “impressão digital” de DNA) são menores que 111 em 101010 \text{bilhões}bilho˜esstart text, b, i, l, h, o, with, \~, on top, e, s, end text^11start superscript, 1, end superscript!Embora possamos pensar na evidência de DNA sendo usada para condenar criminosos, ela tem tido um papel crucial na exoneração de pessoas falsamente acusadas (incluindo algumas que estavam presas há muitos anos). A análise forense também é usada para estabelecer paternidade e identificar restos mortais de cenas de desastres.

Créditos:

Esse artigo é uma derivação modificada de “The polymerase chain reaction,” por CK-12 Foundation (CC BY-NC 3.0).

O artigo adaptado está autorizado sob a licença CC BY-NC-SA 4.0




Como a biologia molecular é definida como ciência?

Biologia Molecular busca compreender os mecanismos de replicação, transcrição e tradução do material genético”. Como estudo genético acaba por se relacionar aos componentes da célula , seus comportamento, interações , sobretudo do código genético, sequencia de aminoácidos, oligopeptíteos, polipeptideos, proteínas; se relaciona com PCR, eletroforese, espectrometria de massas e testes de detecção dos componentes sobretudo genéticos-proteicos. A BM permite ser uma ferramenta com aplicações diversas , principalmente em diagnostico médico. Mas se estende a melhoramento genético , aplicações forenses, pesquisas arqueológicas , etc.

b) Como é possível pesquisar no DNA de um indivíduo o risco de susceptibilidade genética para uma determinada doença? Dê ênfase nas metodologias moleculares utilizadas para esse diagnóstico.


Se souber a doença tem que pesquisar focado nas relações genéticas desta doença. Se não , primeiro fazendo anamnese geral com ênfase em doenças familiares, depois , diante de algumas pistas , fazer testes genéticos por genealogia, aprofundar nas pré-doenças, fragilidades e verificar as mutações mais prováveis por NGS, escolhendo painéis de defeitos relacionados as doenças diagnosticadas generalizadamente, como por exemplo, temos 7 mil mutações que se relacionam ao câncer , principalmente mutações na região do DNA que codifica a P53, 2 mil a diabetes, então bastará dar um zoom por PCR na parte que vc quer ver mais do painel pré-selecionado.

Exemplo, quem tem mutação em ECA e aumenta expressão ECA1/2 tem problemas de hipertensão e predisposição a contaminação pelo virus da covid-19, por se ligar ao virus sars cov-2.

Uma dúvida: Aqueles testes ortomoleculares (em geral feitas por meio de fios de cabelo) que buscam diagnosticar desequilibrios de elementos a mais e a menos , para poder estabelecer o equilibrio de metabólicos por meio de nutrição compensatoria e suplementos, pode gerar pistas genéticas e proteômicas também, aumentando o nível de acerto nos painéis prováveis contendo mutações ?

c) E se o objetivo for o diagnóstico molecular de um patógeno infeccioso, causador de uma determinada doença infecciosa? Como você pesquisaria o DNA de um organismo estranho no tecido de um indivíduo hospedeiro (para confirmar o processo de interação patógeno-hospedeiro)? Dê ênfase nas metodologias moleculares utilizadas para esse diagnóstico.

Coletando material genético que fica localizado nas células alvo deste patógeno, para verificar por meio de PCR se determinado fragmento deste patógeno está presente. Existe teste de eletroforese capilar em gel, usando microchip como na figura abaixo, que consegue detectar fragmentos de patógenos por meio de programação de sensibilidade do sensor para o mesmo. Na passagem do material nestes microtuneis, sob forças elétricas, programa-se a detecção para a “altura” predeterminada de sua detecção, gerando um no aparelho , um pico mais específico. Para tanto usa-se vários softwares com valores de componentes predeterminados como o Peakmaster, ferramenta que pode tanto economizar simulando ações de detecção, permitindo uma melhor programação para a mesma.

d) Leia o trecho: “Este é um procedimento ainda disponível em poucos centros, demorado e de alto custo, especialmente se considerarmos que o gene APC é bastante longo, contendo 8535 pares de bases nitrogenadas. Caso este exame seja possível, e tenha sido possível identificar uma mutação em algum segmento (como uma troca de uma adenina por timina, por exemplo), então estaremos aptos a prosseguir em nosso estudo.” No atual estado da arte da biologia molecular, essa afirmação ainda é totalmente correta?

Não , principalmente devido a PCR e outros métodos mais baratos e rápidos de detecção, contudo não deixa de ser verdadeira quanto a sequenciamento eletrônico que continua muito caro, na última cotação que fiz com a termofishing custava 4.000 dólares por teste em NGS, isso depois de prepararmos o matrial e mandar paa que eles fizessem.

Uma dúvida : No mesmo texto citadohttps://www.scielo.br/pdf/rbc/v26n3/a16v26n3.pdf

, acima dele, se diz “Estima-se hoje que cada célula necessite para seu funcionamento vital de cerca de 10 000 proteínas diferentes, cada uma delas desempenhando uma tarefa específica.” Li em outro artigo que temos 1.800.000 proteínas (não vi nem a distinção de oligopeptideos, polipeptideos, enzimas e hormônios) e acredito que por proteínas estavam sendo generalistas; dentro desta perspectiva , 10.000 proteínas diferentes parece ser até um número pequeno?

e) Quando se torna interessante estudar o RNA e/ou a proteína de um determinado tecido biológico?

odas as células possuem o mesmo repertorio genético. O que muda? os genes que expressam e os não expressos. Temos então dois grupamentos .

housekeepings
https://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1516-89132013000100019

O que é PCR?

1983 foi feito um protocolo para gerar reação em cadeia pela polimerase. Usando tampão pra diluir todos os reagentes e não permitir desnaturação . Amostras…prime que vai controlar polimerização, vai mostrar onde a polimerase vai começar e finalizar ….íons de magnésio e nucleotídeos, e a polimerase.

Antes tinha que acrescentar enzima, porque a enzima desnaturava. Descobriu a extremófilo bacteria e isolou a polimerase resistente desta bacteria.

Uma técnica que permite vc amplificar um trecho especifico de qualquer DNA que consiste em aplicar primes especificos + trechos especificos + polimerase térmica.

Como ocorre o processo de genotipagem/diagnóstico por esse método? Assista aos vídeos abaixo, da Khan Academy. – https://pt.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dnasequencing-pcr-electrophoresis/v/the-polymerase-chain-reaction-pcr

Primeiro vc amplica o trecho que quer aquecendo sua amostra de dna e ao resfriar aplicando junto primes especificos + trechos especificos + polimerase térmica para multiplicar seus trechos especificos

https://pt.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dnasequencing-pcr-electrophoresis/v/gel-electrophoresis-dna

Depois vc coloca aquele material pra correr no gel entre eletrodos + e -, e haverá uma banda bastante abundante do material que predeterminou com primers, nucleotideo e polimerase

>> Vídeos da USP (Vídeos Extras):

– Técnicas de Biologia Molecular – PCR -…

– Técnicas de Biologia Molecular – PCR

– Qual a história da revolucionária técnica de reação em cadeia da polimerase?

Ela revolucionou a maneira mais barata e eficaz de detecção de trechos do DNA

– Fazer uma PCR não é muito diferente de fazer um bolo.

*Há ingredientes – reagentes – primes especificos + trechos especificos + polimerase

*Há modo de preparo – protocolo – aquecimento a 95 graus e resfriamento até 55, quando se coloca os ingredientes e depois aquecendo até 72 graus para que se multipliquem (extensão)

*Há um chef – você

Explique esquematicamente e didaticamente quais são os ingredientes que juntos compõe essa reação de cópia do DNA (ressaltando qual a função de cada reagente) e o modo de preparo. É necessário controle de qualidade rígido para validar os resultados dessa reação?

Primes especificos que comecem a sequenciar aquilo que quer + trechos especificos para servir de molde + polimerase resistente ao calor já que usará o sistema aquecer e desaquecer

1 – Assista o vídeo 1 do Ministério da Saúde – diagnóstico clássico x diagnóstico

molecular:

– https://www.youtube.com/watch?v=ONcf9u8EagQ

2 – LAMP – O diagnóstico revolucionário para COVID-19.


Técnica 

No LAMP, a sequência alvo é amplificada a uma temperatura constante de 60-65 ° C usando dois ou três conjuntos de primers e uma polimerase com alta atividade de deslocamento de fita, além de uma atividade de replicação. Normalmente, 4 primers diferentes são usados ​​para amplificar 6 regiões distintas no gene alvo, o que aumenta a especificidade. Um par adicional de “primers de loop” pode acelerar ainda mais a reação. [3] A quantidade de DNA produzida em LAMP é consideravelmente maior do que a amplificação baseada em PCR .Esquema de um LAMP de biomarcadores de ácido nucleico de amostras brutas de águas residuais não tratadas, para quantificar rapidamente o DNA mitocondrial humano específico (mtDNA). [4]

O produto da amplificação pode ser detectado por fotometria, medindo a turbidez causada pelo precipitado do pirofosfato de magnésio em solução como subproduto da amplificação. [5] Isso permite fácil visualização a olho nu ou por meio de abordagens de detecção fotométrica simples para pequenos volumes. A reação pode ser seguida em tempo real medindo a turbidez [6] ou por fluorescência usando corantes intercalantes como SYTO 9. [7] Corantes, como SYBR green, pode ser usado para criar uma mudança de cor visível que pode ser vista a olho nu, sem a necessidade de equipamentos caros, ou para uma resposta que pode ser medida com mais precisão por instrumentação. As moléculas de corante se intercalam ou marcam diretamente o DNA e, por sua vez, podem ser correlacionadas com o número de cópias inicialmente presentes. Portanto, LAMP também pode ser quantitativo.

A detecção em tubo de amplificação de DNA LAMP é possível usando calceína carregada de manganês que começa a fluorescência após a complexação de manganês por pirofosfato durante a síntese de DNA in vitro. [8]

Outro método para detecção visual dos amplicons de LAMP a olho nu foi baseado em sua capacidade de hibridizar com ss-DNA complementar ligado a ouro e, assim, prevenir a mudança de cor vermelha para azul púrpura normal que de outra forma ocorreria durante a agregação induzida por sal de as partículas de ouro. Assim, um método LAMP combinado com detecção de amplicon por AuNP pode ter vantagens sobre outros métodos em termos de tempo de ensaio reduzido, confirmação de amplicon por hibridização e uso de equipamento mais simples (ou seja, não há necessidade de um termociclador, equipamento de eletroforese ou transiluminador ) [9] [10]


Assista:

– https://www.youtube.com/watch?v=3HwkzWZp-bY
https://www.youtube.com/watch?v=L5zi2P4lggw
https://www.youtube.com/watch?v=V4PyySdk3Jo

*Quando comparamos o LAMP e a tradicional técnica de PCR, aponte:

– Quais são as principais semelhanças e diferenças?

“Em contraste com a PCR e a PCR em tempo real, o tempo de detecção de LAMP é inferior a 1 h porque o gene alvo é amplificado em condições isotérmicas. LAMP é mais específico do que PCR, porque 4 ou 6 primers usados ​​em LAMP aumentam a especificidade ( 45 ).”

PCR usa Taq (polimerase isolada da bacteria thermus aquaticus, LAMP usa LP, no Lamp por ser isotérmica, esse controle é feito pela propria polimerase . Custo menor que a PCR . Ela é mais simples segundo alguns autores. Não precisa usar não varia temperatura, detecção não precisa de eletroforese, pode colocar diretamente pelo teste PH e a olho nu .
https://pt.wikipedia.org/wiki/Taq_DNA_polimerase

– Quais seriam as vantagens e as limitações dessa nova técnica?

LAMP
Os primes dificeis de interagir,
Numero de anelamento é menor que a PCR
Porem pra Covid-19 foi mais rapida

” Embora o curto tempo de detecção e especificidade de LAMP sejam as principais vantagens, a amplificação contínua do gene alvo por LAMP pode ser confundida com produtos de PCR não específicos em eletroforese em gel. A fim de superar esta desvantagem do LAMP, técnicas alternativas de detecção baseadas em LAMP foram propostas recentemente ( 45 , – 48 ). Em uma variação que não usa eletroforese em gel, uma reação positiva foi determinada por Ca 2+precipitação e SYBR verde fluorescente ou corante colorido com inspeção a olho nu ( 45 , 47 ). Além disso, LAMP em tempo real e LAMP baseado em sonda também foram relatados ( 46 , 48 ). Para aumentar a especificidade de LAMP, LAMP baseado em sonda pode ser desenvolvido para a detecção de Arcobacter em pesquisas futuras.” https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3911361/#:~:text=In%20contrast%20to%20PCR%20and,LAMP%20increase%20specificity%20(45).

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